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Una mutación en el gen COQ9 y su asociación con desempeño reproductivo en ganado lechero Holstein

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  • Agosto 12, 2019
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Néstor Gerardo Michel Regalado1, Miguel Ángel Ayala Valdovinos1, Theodor Duifhuis Rivera1

Departamento de Producción Animal, División de Ciencias Veterinarias, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Guadalajara

Resumen

Una mutación del gen COQ9 (rs109301586, Pub Med) en el ganado Holstein se caracteriza por una sustitución de una adenina por una guanina. Esta sustitución genera un cambio en la conformación de la estructura terciaria de la proteína traducida por el gen. La coenzima Q9 es una molécula lipofílica precursora de la coenzima Q, componente indispensable en la cadena de transporte de electrones dentro de la mitocondria. El alelo A ha sido asociado con un mejor desempeño para el comportamiento reproductivo, particularmente para los rasgos de tasa de preñez, días abiertos y número de servicios. En el presente trabajo se diseñó y estandarizó la técnica de diagnóstico molecular por medio de PCR-RFLP para genotipificar los alelos A y G del gen COQ9 y se calcularon las frecuencias génicas en una población de ganado Holstein en un municipio del Estado de Jalisco. Se creó una base de datos con las variables reproductivas a evaluar: intervalo del parto al primer celo, días abiertos y número de servicios por concepción. El genotipo heterocigótico AG se asoció significativamente con un menor número de servicios por concepción (P<0.05) comparado con los individuos homocigóticos.

Introducción

La selección del ganado lechero y la alta especialización para la producción de leche han derivado en una disminución significativa en el desempeño reproductivo de los hatos lecheros (Veerkamp et al., 2003). Desde el año 1989, investigadores de la Universidad de Cornell daban cuenta de la asociación entre la creciente producción lechera y el constante decremento en la tasa de preñez, atribuyendo principalmente ésta reducción al balance energético negativo de la vaca en el postparto, situación que genera un ambiente similar al de la subnutrición y que inhibe la respuesta a las gonadotropinas para la liberación preovulatoria de la hormona luteinizante (Wathes et al., 2007).

En un estudio retrospectivo, evaluando los datos productivos y reproductivos durante un periodo de 10 años (1991- 2000) en la región del noreste de España, López-Gatius (2002) encontró que la producción lechera anual incrementó de 7,800 kg por vaca en 1991 a 10,200 kg en el año 2000, los análisis de regresión revelaron que por cada 1,000 kg de aumento en producción lechera, había un decremento de entre un 3.2% a un 6% en la tasa de preñez, de 4.4% a 7.6% en la ciclicidad y un incremento en la incidencia de ovarios inactivos de entre 4.6% a 8%.

Una situación similar fue reportada en una población de ganado en el Reino Unido (Royal et al., 2000), utilizando determinaciones de progesterona en leche, se compararon los parámetros reproductivos tomados en el periodo de 1975- 1982 con los del periodo 1995-1998. Se encontró que existía un decremento porcentual promedio de un punto por año en la tasa de preñez, incrementándose la proporción de perfiles hormonales atípicos.

Este decremento en el desempeño reproductivo se puede atribuir a que la selección genética ha sido principalmente orientada hacia rasgos de producción de leche, es por esto que es necesaria una herramienta para identificar mutaciones en los genes que tengan una relación directa con un mejor desempeño reproductivo (Beuzen et al., 2000).

El gen COQ9 produce la proteína coenzima Q9, esta participa en la vía de producción de la coenzima Q10 (COQ10), la cual es componente importante en el sistema de transporte de electrones de la mitocondria, éste sistema produce el adenosin trifosfato (ATP), biomolécula que proporciona energía a la célula para realizar sus funciones metabólicas. Se ha identificado una mutación que modifica la estructura terciaria de la proteína coenzima Q9 producida por el gen debido a un cambio conformacional en la estructura de diversas alfa- hélices. Esta mutación se asocia con menores tasas de respiración mitocondrial (Ortega et al., 2017).

Por lo anterior, los ovocitos tienen menor capacidad energética para realizar sus funciones metabólicas y son menos viables. Se ha demostrado en los mamíferos que la proteína coenzima Q9 interacciona con la proteína coenzima Q7 (COQ7) para dar origen al aceptor de electrones COQ10, deficiencias en cualquiera de estas moléculas interfieren con la producción normal de ATP en la mitocondria (García-Corzo et al., 2012). La función precisa de la COQ9 se desconoce aún, pero se sabe que forma parte de un complejo multienzimático encargado de realizar metilaciones, descarboxilaciones e hidroxilaciones hasta formar una molécula quinona funcional, por lo tanto, una deficiencia en alguna de éstas moléculas, como la COQ9, suprimirán la función de la COQ10 (Duncan et al., 2009). Ortega et al., (2017) señalan una relación entre el polimorfismo y tres parámetros de fertilidad en ganado lechero Holstein (tasa de preñez, servicios por concepción y días abiertos).

Si bien es cierto que se han identificado y relacionado diversos polimorfismos con algunos rasgos de fertilidad (Ortega et al., 2017; Hax et al., 2017; Homer et al., 2013; Khatib et al., 2008), hasta el momento no se han reportado estudios donde se muestreen individuos en la región del estado de Jalisco, por lo que éste estudio permitirá estimar la frecuencia alélica del gen COQ9 en una población lechera de ésta región.

La detección de estos polimorfismos por medio de PCR-RFLP (Reacción en Cadena de la Polimerasa- Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica) y su asociación con rasgos reproductivos permitirá establecer una herramienta de selección asistida por marcadores moleculares al alcance de los productores, lo que se verá reflejado en una probable mejoría de la fertilidad global y aumentará las ganancias económicas derivadas de éste concepto, como lo pueden ser el incremento en la producción de leche del hato por una reducción del intervalo entre partos, una reducción en el número de vacas que se desechan por causas reproductivas y un menor gasto de alimentación para animales improductivos (Chebel y Ribeiro, 2016).

Materiales y métodos

Se tomaron 112 muestras de sangre de vacas lactantes Holstein en tubos que contenían anticoagulante, sólo se seleccionaron individuos que contaban con los registros reproductivos completos (fecha de parto, fecha de celos, fecha de inseminaciones y fecha de diagnóstico de preñez).

Posterior al muestreo se realizó la extracción de ADN de la sangre de acuerdo a la metodología descrita por Ayala-Valdovinos et al., (2007). A partir de la secuencia del gen COQ9 se diseñaron los iniciadores delantero y reverso los cuales amplificaron un fragmento de 202 pares de bases.

El fragmento amplificado fue digerido con la enzima de restricción MboI de acuerdo al protocolo recomendado por el proveedor. Posteriormente se realizó una electroforesis y el producto digerido fue visualizado en un gel de agarosa al 4% teñido con un agente intercalante.

Resultados

Mediante la prueba de PCR- RFLP se logró amplificar un fragmento de ADN de 202 pares de bases (Figura 1) y generar un patrón de bandeo para identificar los genotipos de los individuos muestreados.

Los patrones específicos (Figura 2) fueron fragmentos de 82 y 109 pb para el genotipo GG, 82, 109 y 120 pb para el genotipo AG y para el genotipo AA fragmentos de 82 y 120 pb. Los resultados moleculares mostraron evidencia de los tres genotipos en la población muestreada.



En el caso de los individuos heterocigóticos AG se observó una asociación significativa (P<0.05) con un menor número de servicios de inseminación por concepción, requirieron 2.5 servicios en comparación con 3.6 y 3.7 servicios para los homocigóticos AA y GG. No existieron efectos de aditividad significativos para ninguna de las variables del estudio, razón por la cual, no se identificó una influencia directa para estos rasgos a través de los genotipos homocigóticos en vacas AA y GG. Para los efectos de dominancia se encontró significancia estadística al nivel de P<0.05 para las variables de días abiertos y número de servicios, lo que implica una mejora para estos parámetros en vacas heterocigóticas AG, es decir, éstas vacas se preñan 7.6 días antes y requieren 1.1 servicios menos que las vacas con los genotipos homocigóticos AA y GG.

Discusión

El pobre desempeño reproductivo y  los factores que se ven implicados en éste fenómeno han sido profundamente investigados, para examinar la posibilidad de que algunos rasgos  reproductivos son asociados con la presencia de una mutación, se estandarizó la prueba de PCR-RFLP y se investigó la asociación estadística entre 3 variables reproductivas (intervalo del parto al primer celo, días abiertos y número de servicios) con los diferentes genotipos en el gen de la coenzima Q9.

El gen COQ9 produce una molécula esencial para la síntesis de ATP mitocondrial y otros procesos metabólicos, las mutaciones en los genes que participan en la biosíntesis de la COQ generan deficiencia de ésta molécula y conducen a estados patológicos o deterioros en algunos sistemas (García-Corzo et al., 2012).

Ortega y colaboradores (2017) evaluaron los efectos del polimorfismo (18:25527339) en el comportamiento reproductivo de 2,273 vacas Holstein localizadas en los estados de Florida y California. Ellos encontraron que las vacas con el genotipo homocigótico AA tuvieron mayor tasa de preñez, requirieron menor número de servicios por concepción y tuvieron menos días abiertos (P<0.05) en comparación con las vacas del genotipo GG.

Adicionalmente midieron la expresión de transcritos de COQ9 en células del cumulus y en ovocitos, encontrando un efecto de dominancia, ya que el genotipo heterocigótico AG presentó mayor abundancia en los ovocitos (P<0.05), no así en las células del cumulus. En el caso de los homocigóticos, la abundancia fue menor y no se encontraron diferencias entre ellos. Una situación similar fue encontrada cuando recuperaron complejos cumulus oophorus y midieron concentraciones de la hormona antimulleriana, siendo los heterocigóticos los que presentaron los mayores valores (P<0.05).

En el presente estudio se encontró un efecto favorable del genotipo AG para la variable número de servicios (P<0.05), siendo los heterocigóticos quienes demostraron el mejor desempeño reproductivo. Ésta información concuerda con los resultados del análisis de regresión para los efectos de dominancia donde existió significancia estadística para el número de servicios y días abiertos (P<0.05).

Aunque en esta investigación no se realizaron mediciones de hormona antimulleriana ni se realizó un conteo de la población folicular, el efecto de dominancia encontrado en el estudio de Ortega et al., (2017) es interesante ya que se ha demostrado que los altos niveles de hormona antimulleriana se relacionan con una mayor población folicular, una mayor longevidad en el hato y un mejor desempeño reproductivo (Jimenez-Krassel et al., 2015), por lo que sería de gran importancia realizar éstas mediciones en estudios posteriores para determinar si existe tal relación.

El hecho de que los heterocigóticos demuestren un comportamiento superior respecto del alelo mejorante, como lo encontrado en este estudio y en el de Ortega y colaboradores (2017) puede ser debido a un efecto de sobredominancia, donde las diferentes moléculas producidas tengan propiedades distintas en cuanto a su actividad, estabilidad en ciertas condiciones, sensibilidad para trabajar, entre otras, generando un desempeño más versátil y menos susceptible al deterioro comparado con los homocigóticos, un ejemplo de una situación similar fue encontrado en ovejas con una mutación en el gen FecX1, los heterocigóticos tuvieron una mayor tasa de ovulación comparado con los homocigóticos silvestres, mientras que los homocigóticos mutantes fueron infértiles (Smith et al., 1997).

Hasta el momento no existen otros estudios donde se reporten las frecuencias y los efectos del gen en México, la técnica que se desarrolló para genotipificar a las vacas en el presente trabajo puede ser implementada en el laboratorio sin la necesidad de equipos y reactivos costosos. Si bien se encontró asociación estadística con una de las variables analizadas, es necesario realizar más estudios en diferentes poblaciones y con un número mayor de individuos para determinar si éstos resultados son reproducibles en los diferentes sistemas de producción.

Conclusiones

Fue posible identificar los polimorfismos del gen coenzima Q9 por medio de la técnica de PCR-RFLP en una población de ganado Holstein. El alelo G tuvo mayor frecuencia que el alelo A, observándose una mayor proporción de individuos heterocigóticos y la menor proporción de homocigóticos mutantes y homocigóticos silvestres.

El genotipo AG mostró una relación favorable para la variable número de servicios, además existió un efecto de dominancia significativo para esta variable, por lo que éste polimorfismo podría utilizarse como una estrategia de selección molecular para mejorar el desempeño reproductivo en las explotaciones lecheras.

Referencias

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