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Evaluación de un polipéptido de Subolesina como posible vacuna contra garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus en bovinos

  • Junio 08, 2021
  • 1,617
Autor: Rodolfo Esteban Lagunes Quintanilla1
Colaboradores: Nancy N. Mendoza-Martínez2, J. Octavio Merino-Charrez3, Miguel A. Alonso-Díaz2, Agustín Fernández-Salas2


1Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad (CENID-SAI), Jiutepec, Mor., México.

2Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical (CEIEGT), Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UNAM. Tlapacoyan, Ver., México.

3Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Tamaulipas. Cd. Victoria, Tam., México.

INTRODUCCIÓN

La garrapata común del ganado Boophilus microplus, reclasificada como Rhipicephalus (Boophilus) microplus, es la especie de mayor importancia económica y sanitaria en las regiones tropicales y subtropicales del mundo. Una infestación elevada en los bovinos, se refleja en la disminución de la producción de carne y leche, daños en la piel, aumento en los costos por tratamientos e incremento en la transmisión de enfermedades como babesiosis (causada por los parásitos protozoarios Babesia bigemina y B. bovis) y anaplasmosis (causada por Anaplasma marginale) (Rodríguez-Vivas et al. 2017).

En el ganado lechero, las garrapatas provocan abscesos que lesionan y atrofian la glándula mamaria. Una garrapata succiona de 0.5 a 3 ml de sangre durante su vida parasítica, estimando que por cada hembra repleta de R. microplus se pierden 8.9 ml de leche (Nolan et al. 1989). Por otra parte, la irritación causada por la picadura tiene un efecto depresivo sobre la producción de carne, reduciendo la ganancia de peso de 0.28 a 0.8 kg. por garrapata/año en animales en crecimiento (Sutherst et al. 1983). En el ganado de engorda, cada garrapata adulta ingurgitada ha demostrado reducir 0.6 g la ganancia de peso diaria, del cual el 65% se atribuye a la inapetencia inducida por la infestación del hospedador. Lew-Tabor et al. (2014), reportó que las infestaciones por garrapatas R. microplus en el mundo, ocasionan pérdidas económicas de 2.5 billones de dólares anuales. Para el caso de México, Rodríguez-Vivas et al. (2017), calculó pérdidas anuales por 573 millones de dólares, reflejando el impacto que tiene la garrapata R. microplus en la producción bovina nacional.

En el país, la ganadería bovina se estima en 35.2 millones de cabezas de ganado (SIAP, 2019), constituyendo una de las principales actividades del sector agropecuario. Este sector se ve fuertemente amenazado por la presencia de garrapatas en regiones donde las condiciones son idóneas para su reproducción. R. microplus se distribuye aproximadamente en el 65.96% del país (Figura 1), se considera un problema de prioridad nacional, ya que limita la comercialización y movilización de animales dentro y fuera del país afectando la exportación de ganado en pie a los Estados Unidos; una actividad económicamente atractiva que genera divisas por el orden de los 1,100 millones de dólares anuales (González, 2018).



La principal estrategia de control de R. microplus ha sido mediante el uso de agentes químicos denominados ixodicidas. Desafortunadamente, su uso continuo e indiscriminado ha generado poblaciones de garrapatas resistentes a la mayoría de los productos disponibles en el mercado (Contreras et al. 2019); aunado a esto, los ixodicidas presentan serios inconvenientes como: altos costos para el desarrollo de nuevas moléculas, toxicidad en mamíferos, residualidad en productos alimenticios y contaminación ambiental. Lo anterior, sugiere que las estrategias de control basadas en ixodicidas no representan la mejor solución, lo cual conduce a la búsqueda de nuevas alternativas de control.


El control inmunológico, basado en el uso de vacunas ofrece una alternativa más atractiva y amigable que el uso de ixodicidas, además presenta diversas ventajas como: efecto de larga duración, no genera residuos en los productos alimenticios y no contamina el ambiente. Actualmente, la única vacuna comercial se basa en la glicoproteína Bm86, localizada en células intestinales de la garrapata R. microplus, la cual se produce de manera recombinante y se distribuye en América Latina. Ésta vacuna controla las infestaciones de garrapatas en un 60% aproximadamente y coadyuva a reducir las enfermedades que transmiten. No obstante, tiene una limitada eficacia contra especies distintas a R. microplus y una efectividad variable dependiendo la zona geográfica debido a la presencia de polimorfismos en el gen codificador de la proteína que conlleva a variaciones en aminoácidos (Garcia-Garcia et al. 1999). Además del antígeno Bm86 y sus variantes, recientemente se han caracterizado diferentes antígenos que se encuentran en fase experimental como candidatos a vacuna; extractos de glándula salival, proteínas ribosomales, aquaporinas entre otros (Guerrero et al. 2014). Estos antígenos al ser inoculados en animales producen anticuerpos, que al contacto con las garrapatas, provocan lisis en células intestinales y consecuentemente reducción en la supervivencia del artrópodo, disminuyendo los parámetros reproductivos y causando la muerte; aunado a esto, la vacunación con otras proteínas involucradas en la interacción garrapata-patógeno han demostrado reducción de la infestación e infección por patógenos, lo cual respalda el uso de candidatos potenciales para el desarrollo de una vacuna que controle las infestaciones por garrapatas y las enfermedades que transmiten (Merino et al. 2013).

La proteína Subolesina, descubierta en la garrapata Ixodes scapularis, se encuentra presente en los diferentes estadios de la garrapata y en varios órganos como intestino, glándula salival y ovarios (Almazán et al. 2010). Actualmente, se sabe que es eficaz como un antígeno protector, y es estructural y funcionalmente ortólogo de las akirinas en insectos y vertebrados (Merino et al. 2019). Subolesina ha sido ampliamente estudiada por diversos grupos de investigación, donde se ha observado que, al inmunizar bovinos, éstos producen anticuerpos protectores que afectan los diferentes estadios de las garrapatas. En el año 2016, Lagunes (et al.) diseñaron y sintetizaron un polipéptido recombinante basado en los epítopos de células B predichos en la secuencia de aminoácidos de la proteína Subolesina mediante análisis bioinformáticos, el cual, fue evaluado en un ensayo preliminar de inmunización en bovinos y desafiados contra garrapatas R. microplus. Dicha evaluación mostró una reducción en el número de garrapatas alimentadas y en la eclosión de larvas, sin observar algún efecto adverso en el peso de las garrapatas ingurgitadas y en la oviposición. Por lo cual, el objetivo del presente estudio es confirmar el efecto inmunoprotector del polipéptido de Subolesina mediante un ensayo de alimentación artificial capilar y un ensayo de inmunización en bovinos bajo condiciones naturales.

MATERIAL Y MÉTODOS

El presente estudio fue realizado de manera compartida en la Unidad de Artropodología del CENID-SAI, INIFAP, en el Laboratorio de Parasitología y Biología Molecular de la FMVZ-UAT y en el Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical (CEIEGT) de la FMVZ-UNAM.

  1. Alimentación artificial capilar de garrapatas microplus

Se utilizó como material biológico la cepa de garrapatas R. microplus “Media Joya”, perteneciente al germoplasma del CENID-SAI, INIFAP. Se seleccionaron 8 muestras de suero hiperinmune obtenidas de 2 bovinos inmunizados previamente con el polipéptido de Subolesina (Lagunes et al., 2016); dichos sueros fueron evaluados mediante la técnica de ELISA indirecto para determinar el nivel de anticuerpos IgG anti-subolesina mediante un espectrofotómetro lector de ELISA a 405 nm. Las muestras de suero utilizadas corresponden a la semana 0, 3, 5 y 7. Los sueros de la semana 0 (preinmune) fungieron como grupo testigo; los sueros de la semana 3 tenían un nivel de anticuerpos de 0.7 OD405 nm, los de la semana 5 de 0.5 OD405 nm y los de la semana 7 presentaban el nivel más alto con 2.9 OD405 nm. Adicionalmente, se obtuvo 100 ml de sangre completa a partir de un bovino proveniente de una zona libre de garrapatas y con antecedentes de no haber sido inmunizado ni tratado con ixodicidas. La sangre se dividió en 8 grupos y se mezcló con los sueros respectivamente para llevar a cabo el ensayo de alimentación artificial capilar. La relación de sangre - suero fue de 4:1 unidades. Por otra parte, se utilizaron larvas de garrapatas R. microplus cepa “Media Joya”, las cuales fueron alimentadas parcialmente sobre dos bovinos hasta el día 20 post-infestación; posteriormente fueron removidas cuidadosamente. Las garrapatas con daños en piezas bucales y con un peso <25 mg o >60 mg se descartaron; las viables se utilizaron para formar 8 grupos experimentales conformados por 10 garrapatas cada uno. La alimentación se realizó fijando a las garrapatas en cinta adherible de dos caras e insertando las piezas bucales en tubos capilares para hematocrito. Los tubos fueron reemplazados de acuerdo al consumo de sangre, aproximadamente cada 2-3 horas durante 48 horas con base en protocolos establecidos por Antunes et al. (2014). Después del proceso de alimentación, las garrapatas fueron pesadas nuevamente para determinar la ingesta de sangre, se colocaron en viales y se mantuvieron en incubadora a 27°C y 80% de humedad relativa para permitir la oviposición a las 2 semanas posteriores. Los resultados del peso de las garrapatas repletas y el peso de la masa de los huevos se compararon entre los grupos experimentales utilizando la prueba de t-student para varianzas desiguales (P<0.05).

  1. Ensayo de inmunización

El ensayo se llevó a cabo en un área experimental del módulo de producción de doble propósito del CEIEGT (FMVZ-UNAM). Se utilizaron 12 bovinos hembras (Bos primigenius taurus por Bos primigenius indicus) de 12-15 meses de edad con un peso promedio de 250 kg., los cuales fueron distribuidos en 2 grupos de 6 bovinos. Los animales fueron mantenidos bajo un esquema de pastoreo rotacional de 3 días de ocupación con 28 días de descanso en potreros con sospecha de cargas parasitarias elevadas de garrapatas R. microplus. Adicionalmente, fueron desparasitados con Albendazol al 10% adicionado con Sulfato de Cobalto y dejaron de recibir tratamientos ixodicidas 3 meses previos al comienzo del ensayo. El primer grupo fue inmunizado con el polipéptido de Subolesina más adyuvante Montanide (ISA 50 V2, Seppic®); el segundo grupo únicamente fue tratado con solución salina más adyuvante. Se administraron 3 dosis de 100 µg en un volumen final de 2 ml por dosis, los días 0, 30 y 65. La inmunización se llevó a cabo vía subcutánea utilizando jeringas de 5 ml con agujas de 18G.

  1. Infestación

Para la aplicación en condiciones naturales, se realizaron conteos de garrapatas de lado derecho de los animales cada siete días desde el día cero previo a la primera inmunización y hasta el día 180 cuando finalizó el experimento. Se colectaron todas las garrapatas R. microplus en proceso de repleción (4-8 mm), las cuales fueron pesadas y depositadas en cajas de Petri. Posteriormente, se incubaron a 27oC y humedad relativa de 80% para permitir la oviposición y eclosión a las 2 y 5 semanas, respectivamente.
 

  1. Determinación de la cinética de anticuerpos

Se obtuvieron muestras de sangre de los animales cada 15 días durante 24 semanas. Las muestras fueron colectadas de la vena coccígea en tubos con anticoagulante y el suero se obtuvo por centrifugación a 6000 rpm y almacenado a -20oC hasta su uso. La cinética de anticuerpos se determinó mediante la técnica de ELISA indirecto de acuerdo al siguiente protocolo: Se utilizó 1 µg/pozo del polipéptido de Subolesina purificado para cubrir la placa de ELISA y se incubó a 4o C durante toda la noche. Los sueros fueron diluidos 1:100 en solución salina amortiguada con fosfatos y adicionada con tween 20 al 0.05% (PBS-T 0.05%) con un pH de 7.2 y 5% de leche descremada. La placa fue incubada con el suero diluido durante 1 hora a 37°C y posteriormente incubada con el conjugado (anti-IgG de bovino acoplado a fosfatasa alcalina) 1 hora a 37°C. La reacción de color se desarrolló con p-Nitrofenil-fosfato y la densidad óptica se determinó en un lector de ELISA a 405 nm. Los niveles de anticuerpos fueron considerados positivos cuando el valor de la absorbancia fue de al menos dos veces el valor del suero preinmune.

  1. Evaluación de resultados

Los parámetros a evaluar en las garrapatas R. microplus fueron: a) el número de garrapatas hembras repletas, b) el peso de las garrapatas repletas, c) el peso de la masa de huevos y d) porcentaje de eclosión. Se calcularon los datos porcentuales de cada una de las variables de acuerdo con la metodología descrita por de la Fuente et al. (1999). Los resultados fueron evaluados estadísticamente utilizando la prueba de t-student para varianzas desiguales (P<0.05), con la finalidad de comparar los resultados entre los grupos experimentales, así como para comparar los resultados de la determinación de la cinética de anticuerpos por ELISA indirecto.

RESULTADOS

Los resultados obtenidos al finalizar el ensayo de alimentación artificial capilar se muestran en la figura 2, donde se observa el procedimiento para alimentar a las garrapatas (2A) y el peso promedio de las garrapatas repletas, así como el peso promedio de la masa de huevos (2B). En la semana 0, el cual corresponde al grupo testigo (preimmune) se presentó una ingesta adecuada de sangre, aumentando la ganancia de peso de las garrapatas gradualmente durante las 48 horas que duró el experimento. A partir de la semana 3 y hasta la semana 7 se observaron diferencias estadísticamente significativas (P<0.05) en los pesos promedios de las garrapatas analizadas, obteniendo una ganancia de peso mínima en la semana 3 y 5 a diferencia de la semana 7 donde se observó un incremento de peso. Adicionalmente, se observó la presencia de 13 garrapatas muertas en los diferentes grupos experimentales.



Con respecto a la oviposición, se observó en el grupo testigo un peso promedio en la masa de huevos usual a diferencia de las semanas 3, 5 y 7 (P<0.05); el cual fue decayendo gradualmente conforme aumentaba el nivel de anticuerpos. Interesantemente, en la semana 7 se obtuvo la menor postura de huevos debido a que solo 4 garrapatas ovipositaron. De acuerdo con los resultados obtenidos en este ensayo, se sugiere que la baja ganancia de peso de las garrapatas, así como la disminución gradual en la oviposición es debido al efecto de los anticuerpos IgG anti-subolesina presentes en los sueros hiperinmune obtenidos en las semanas de estudio (Figura 3A y 3B).




En el ensayo de inmunización, se obtuvo una disminución del 53% en el número de garrapatas, 8% en el peso de las garrapatas, 16% en el peso de la masa de huevos y 19% en la tasa de eclosión (Cuadro 1). Con los datos obtenidos en los diferentes parámetros medidos, se obtuvo un resultado final que corresponde a la eficacia general de la vacunación, el cual fue de 67%. Así mismo, existieron diferencias estadísticamente significativas para 3 de los 4 parámetros analizados (P<0.05).




En la figura 4 se muestra la cinética de anticuerpos durante las 24 semanas de estudio. Los resultados obtenidos a partir de las muestras de suero, demuestran que los bovinos inmunizados con el polipéptido de Subolesina montaron una respuesta inmune efectora contra garrapatas, observando que después de la segunda y tercera dosis los niveles de anticuerpos aumentaron considerablemente, llegando a su punto más alto en la semana 10 (P<0.05). Posteriormente, los niveles comenzaron a disminuir gradualmente hasta el final del experimento; sin embargo, para la semana 24 los bovinos aún presentaban niveles de anticuerpos por arriba de 1.0 OD405 nm.



DISCUSIÓN


Los métodos inmunológicos son una herramienta promisoria para el control de garrapatas, debido a que presentan eficacia cuando se utilizan adecuadamente. De acuerdo con los resultados obtenidos, el polipéptido de Subolesina mostró un efecto positivo sobre la reducción de la infestación de R. microplus, lo que significa que a) la alimentación capilar confirmo la disminución del peso y oviposición de las garrapatas, b) los bovinos inmunizados desarrollaron anticuerpos contra el antígeno y c) como consecuencia existió reducción en todos los parámetros reproductivos de las garrapatas. Estos datos concuerdan con estudios anteriores (Almazán et al. 2010; Merino et al., 2013; Shakya et al. 2014). Sin embargo, no se había diseñado un antígeno a partir de una región inmunogénica basado en epítopos B predichos mediante programas bioinformáticos con la finalidad de aumentar el efecto inmunoprotector.

Los resultados alcanzados en el ensayo de alimentación artificial capilar concuerdan con los niveles de anticuerpos mostrados por Lagunes et al. (2016), donde se observó una respuesta inmune secundaria en los bovinos al momento de exponerlos a una segunda dosis del inmunógeno en cuestión. Por lo cual, la cantidad de anticuerpos circulantes en los animales era fácilmente perceptible y elevado. Los trabajos que se han realizado con la proteína Subolesina siempre han mostrado un efecto protector que ronda entre el 60% de eficacia general (Almazán et al., 2010; Merino et al., 2013). En cuanto al resultado obtenido en la inmunización con el polipéptido de Subolesina, se confirmó que es posible controlar las infestaciones por garrapatas R. microplus mediante la vacunación con este antígeno (Shakya et al. 2014; Lagunes et al. 2016; Kasaija et al. 2020). Los parámetros evaluados en R. microplus demostraron que existe un efecto considerable, lo más destacado es el 53% (P<0.05) de reducción en el número de hembras adultas y la eficacia general de la vacunación del 67%. Estos hallazgos son similares con lo reportado por Merino et al. (2013), donde obtuvieron una reducción del 47% en el número de garrapatas, 18% en oviposición y una eficacia general de la vacunación de 60% en bovinos bajo condiciones controladas. Interesantemente, los resultados alcanzados en este ensayo bajo condiciones naturales indican que el polipéptido de Subolesina es un candidato vacunal de importancia.

Por otro lado, se encontró que la cinética de anticuerpos en el grupo inmunizado con el polipéptido de Subolesina mostró una respuesta típica, es decir, estuvo acorde con cada inmunización, pero en general el nivel de anticuerpos en los bovinos inmunizados fue bajo en comparación con otros estudios (Shakya et al. 2014; Lagunes et al. 2016). Lo anterior puede deberse a varios factores como el manejo del inmunógeno, el adyuvante empleado o la baja estimulación del sistema inmune de los animales empleados en el experimento. A pesar de esto, se confirmó la capacidad inmunogénica del polipéptido de Subolesina, lo cual se refleja con los niveles de anticuerpos posteriores a la segunda y tercera inmunización que se mantienen elevados durante algunas semanas y disminuyen al final del experimento. Estos resultados sugieren que la eficacia en la disminución de la infestación de garrapatas R. microplus fue debida a la respuesta inmune protectora generada por los anticuerpos, lo que está acorde con resultados similares encontrados por Almazán et al. (2010), Merino et al. (2013); Shakya et al. (2014); Lagunes et al. (2016); Contreras et al. (2019) y Kasaija et al. (2020).  

CONCLUSIÓN


Este es el primer trabajo de investigación que evalúa la capacidad protectora de un polipéptido de Subolesina para controlar infestaciones de garrapatas R. microplus mediante alimentación artificial capilar e inmunización de bovinos en condiciones naturales. Se concluye que el polipéptido de Subolesina es inmunogénico y capaz de producir anticuerpos protectores. Esto sugiere que existió una reacción específica antígeno-anticuerpo y dirigida hacia los epítopos contenidos en esa región de la proteína Subolesina. A esta capacidad se le atribuye un efecto adverso en los parámetros reproductivos de las garrapatas, por lo cual, es importante considerar el uso de vacunas como un componente más dentro de un programa de control integrado de garrapatas que afectan a la ganadería bovina, disminuyendo la utilización de ixodicidas, evitando la contaminación ambiental, coadyuvando con la producción de alimentos inocuos y disminuyendo los problemas de salud pública. 

 

REFERENCIAS
 

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COMENTARIOS

Maria del Carmen Porragas | Veracruz, México
11 de Jun, 2021 06:50:26 pm

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Me gustó mucho el artículo, se me hizo muy interesante. ¿Cuándo saldrá el producto para venta al público?

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