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Capacidad de formación de biofilm de Staphylococcus aureus multi - resistentes aislados de mastitis bovina

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  • Febrero 12, 2019
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Autor: Estefanía Salinas Pérez
Colaboradores: Guzmán Rodríguez JJ., Gutiérrez Chávez AJ.
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Autor (es): Salinas-Pérez E.; Guzmán-Rodríguez, JJ., Gutiérrez-Chávez, AJ.

P.E. Medicina Veterinaria y Zootecnia. Dpto. Veterinaria y Zootecnia. División de Ciencias de la Vida, Universidad de Guanajuato.

 

Resumen

El objetivo del presente estudio fue determinar la capacidad de formación de biofilm por Staphylococcus aureus multirresistentes aislados de mastitis bovina. El impacto en el incremento de la mastitis subclínica por S. aureus en las vacas lecheras, su creciente resistencia a los antimicrobianos y la baja efectividad de los tratamientos, pueden estar relacionados con la capacidad de la formación de biofilm por parte del microorganismo. Por ello, se utilizaron 20 aislamientos de S. aureus multirresistentes a antibióticos convencionales procedentes de casos de mastitis subclínica bovina. Para medir la capacidad formadora de biofilm, se utilizó el protocolo de tinción cristal violeta. Los estafilococos seleccionados se dividieron en dos grupos: a) aislamientos con mediana susceptibilidad y b) aislamientos con alta resistencia. Los datos se analizaron con un análisis de varianza (ANDEVA) con un diseño factorial completamente aleatorio, el ensayo se realizó con tres experimentos independientes por sextuplicado. Los resultados mostraron que con base en su grado de susceptibilidad antimicrobiana (sensible o resistente), se observó que el 100% de éstos tuvieron la capacidad de formar biofilm en diferente grado; sin embargo, al comparar los resultados de los grupos de aislados, los S. aureus sensibles tuvieron en promedio de 35.6%, mientras que los aislados del grupo resistente mostró un promedio de 61.9%, siendo la diferencia significativa (P<0.000). La formación de biofilm no siempre puede ser considerado como un factor de virulencia, dado que muchas bacterias patógenas lo producen, sin embargo, la formación de biofilm por ciertos patógenos puede facilitar la supervivencia en el medio ambiente y huésped, existe una correlación significativa entre la producción de biofilm y la resistencia a los antibióticos, la razón detrás de la resistencia se debe a la persistencia a largo plazo de bacterias en biofilm en diversos ambientes. Por lo anterior, en el presente estudio se concluye que la capacidad de formación de biofilm por S. aureus de aislados de casos de mastitis subclínica bovina ésta relacionada directamente con el elevado grado de resistencia a los antimicrobianos.

Palabras clave: Resistencia, biofilm, S. aureus, mastitis bovina.

 INTRODUCCIÓN

La producción eficiente de una leche saludable es la principal misión de una granja lechera. La salud de la glándula mamaria es esencial para maximizar la producción de leche y la rentabilidad, con lo que se garantiza la seguridad y calidad de la leche, y los diferentes productos lácteos, así como la disminución del uso de antibióticos en la granja (Smith, 2010).

La mastitis es la enfermedad más común y costosa en el ganado bovino lechero, ya que afecta el bienestar de la vaca y causa problemas económicos por pérdidas en producción, disminución de calidad y cantidad de leche, eliminación prematura de la vaca, costo de tratamiento veterinario y el descarte de la leche debido a la contaminación con antibiótico. La mastitis clínica es solo una pequeña fracción del problema, siendo la presentación subclínica la de mayor incidencia y prevalencia en los rebaños (Taponen et al., 2017; Martínez-Sigales, 2016).

Staphylococcus aureus es un patógeno ubicuo que causa una variedad de infecciones en humanos y animales. Se reconoce como un importante patógeno que causa mastitis subclínica en vacas lecheras, lo que puede llevar a pérdidas económicas severas en todo el mundo; en la mayoría de los países, el aislamiento de S. aureus comúnmente se obtiene en muestras de leche de mastitis bovina (Coelho et al., 2011).

La resistencia de los estafilococos a los antibióticos es un gran obstáculo para el tratamiento exitoso de la mastitis en el ganado lechero, aunque hay muchas razones para el fracaso del tratamiento de la mastitis, siendo la variedad de cepas la principal razón del fracaso (Quinn et al., 2011).

La habilidad de este microorganismo para causar gran variedad de problemas se debe a sus factores de virulencia. Como muchos patógenos bacterianos, S. aureus puede unirse a superficies, acumular biomasa y formar una comunidad de células encerradas en una matriz extracelular llamada “biofilm”. En diversos estudios se ha informado que las cepas de S. aureus que producen biofilm son más virulentas; además de que puede adherirse a cualquier superficie, ofreciendo a los microorganismos una serie de beneficios para su permanencia (Menareh et al., 2017).

El biofilm formado por S. aureus aumenta significativamente la resistencia a los antibióticos, al inhibir la penetración del antimicrobiano lo que resulta en una situación cada vez más grave desde el punto de vista de salud pública (Chen, et al., 2016). Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue determinar la capacidad de formación de biofilm por Staphylococcus aureus multirresistentes aislados de mastitis bovina.

 
ANTECEDENTES

Cada vez hay más evidencia de que S. aureus puede formar biofilm en la ubre de las vacas que sufren mastitis. Los biofilm impiden la acción tanto del sistema inmune del huésped y la acción antimicrobiana, permitiendo la persistencia de la infección (Melchior et al., 2006). Las infecciones causadas por el biofilm son difíciles de tratar, especialmente debido a las características de la comunidad colonizadora que siempre conduce a un gran aumento de la resistencia a los químicos antimicrobianos (una disminución de alrededor de 1000 veces en la susceptibilidad) en comparación con las células planctónicas (Taraszkiewicz et al., 2013) en un estudio, con un número limitado de cepas, se demostró que las cepas productoras de biofilm son menos susceptibles a antimicrobianos (Melchior et al., 2006, 2007). La formación de biofilm por S. aureus está influenciado por factores ambientales como los azúcares (glucosa y/o lactosa) o proteasas presentes en el medio de crecimiento y depende también de la composición genética de un aislado de S. aureus en particular (Melchior et al., 2009).

Como ya se mencionó la mastitis es un tema muy estudiado desde perspectivas tanto clínica como financiera, debido a las pérdidas que representa dentro de una granja lechera. Las investigaciones de esta afección han ayudado a resolver algunos de los factores que desencadenan esta patología; sin embargo, lo que no se ha logrado es disminuir el uso de antimicrobianos en campo, lo cual ha conllevado a tener casos clínicos de mastitis severos por la resistencia antibacteriana. Debido a esto es importante señalar que se requiere de estudios para aportar información que pueda ayudar a la solución de la mastitis.


JUSTIFICACIÓN

Uno de los factores de virulencia de las bacterias es la formación de biofilm, el cual presenta varios mecanismos que intervienen con tratamiento y curación eficaz en la infección por bacterias, en este caso se enfocó en S. aureus, quien presenta la capacidad de formar biofilm en diversos ambientes.

Si bien en medicina humana es donde ese tiene mayor investigación en casos de infecciones persistentes nosocomiales ocasionadas por la presencia de biofilm en prótesis e implantes médicos, así mismo es un tema de amplio en odontología humana, la mayoría de los estudios se basan en la dificultad para tratar dichas infecciones por la resistencia antibacteriana que se ha generado en los últimos años.

Existen muy pocas investigaciones sobre biofilm en medicina veterinaria, sin embargo, los estudios que se tienen son en ganado lechero, sobre todo en mastitis, pero los pocos que se han realizado han sido en América del Sur, Europa y Asia, mientras tanto en México no se cuenta con un estudio de mastitis y bacterias con capacidad de formar biofilm.

Un punto importante con las bacterias con la capacidad de expresar sus factores de virulencia en especies de producción es el riesgo que implica en la seguridad alimentaria ya que los productos de origen animal contaminados pueden ser el vehículo para bacterias con estas características en la cadena trófica y provocar problemas serios en la salud pública.

La frecuencia de mastitis por S. aureus va en incremento y la resistencia antimicrobiana cada vez toma mayor importancia en las explotaciones lecheras. Este estudio es una herramienta en la descripción de los factores de virulencia de S. aureus en casos de mastitis bovina con recurrencia y cronicidad, por lo anterior el objetivo del presente estudio es relacionar la multirresistencia de los aislados con su capacidad de formación de biofilm.

 
OBJETIVO

Determinar la capacidad de formación de biofilm de Staphylococcus aureus multirresistentes aislados de mastitis bovina.

MATERIALES Y MÉTODOS


Unidad y lugar de estudio

Se utilizaron 20 aislamientos de S. aureus multirresistentes a antibióticos convencionales. Estos aislados pertenecen a la colección de material biológico del banco de Patología Veterinaria. Los aislamientos de S. aureus procedieron de casos de mastitis subclínica de vacas localizadas en granjas lecheras bajo sistemas de producción intensiva y de traspatio. El estudio se realizó en el Laboratorio de Proteómica Funcional de la División de Ciencias de la Vida de la Universidad de Guanajuato.

Análisis de la formación de biofilm

Para medir la capacidad formadora de biofilm de los aislados de S. aureus se utilizó el protocolo de tinción con cristal violeta, siguiendo la metodología descrita por Chen et al. (2016).

 
Análisis estadístico

Los datos se analizaron con un análisis de varianza (ANDEVA) con un diseño factorial completamente aleatorio el modelo incluyó dos factores: grado de resistencia: media (sensible a seis de doce antibióticos) y alta (resistente a doce de doce antibióticos). En el ensayo se realizaron tres experimentos independientes por sextuplicado. La base de datos quedó integrada por un total de 360 observaciones. El modelo establecido fue:

Y= [µ+Grado de resistencia+aislado+ (Grado de resistencia) (aislado)+e]

Se evaluaron las interacciones de primer orden y la comparación de medias se realizó con el método de Tukey (p<0.05). Los datos fueron analizados con el paquete estadístico Statgraphics Centurion versión 16.1.


RESULTADOS

De los aislados de S. aureus seleccionados para este estudio con base en su grado de susceptibilidad a antimicrobianos (sensible o resistente), se observó que el 100% de éstos tuvieron la capacidad de formar biofilm en diferente grado.

Por un lado, con relación al grupo de aislados de S. aureus sensibles, se pudo apreciar que la capacidad de formación de biofilm osciló de 22.5 a 50.8% con relación a la cepa de S. aureus (ATCC) con capacidad formadora de biofilm utilizada como control positivo (Figura 1). En la misma figura se puede observar que con excepción del aislado número dos, el resto de S. aureus mostraron una diferencia significativa en comparación al control positivo (P<0.000).

Por el otro, los aislados de S. aureus resistentes a antimicrobianos convencionales presentaron una capacidad de formación de biofilm que osciló de 42.3 a 88.5% (Figura 2). En el caso de los aislados 2 al 7, no se observaron diferencias significativas (P>0.05), lo que indica que los porcentajes de formación de biofilm fueron similares al valor de referencia de la cepa ATCC de S. aureus (100%). Para los aislados 1, 8, 9 y 10, éstos sí mostraron una diferencia significativa en comparación a la cepa control positivo (P<0.000).

Finalmente, al comparar los resultados de la capacidad de formación de biofilm entre los grupos de aislados, se observó que el promedio para el grupo de S. aureus sensibles el porcentaje promedio fue de 35.6%, mientras que los aislados del grupo de S. aureus resistentes mostró un promedio de 61.9%. La diferencia entre ambos grupos fue de 1.7 veces mayor capacidad en la formación de biofilm de los aislados resistentes, en comparación con los S. aureus sensibles (P<0.000) (Figura 3).



DISCUSIÓN

Con base en los resultados obtenidos para determinar la capacidad de formación de biofilm en los aislados de S. aureus seleccionados en el presente estudio, se observó que todos ellos mostraron la capacidad de formar una biofilm. Sin embargo, es necesario mencionar que la comparación de resultados está fuertemente influenciada por múltiples y diversos factores que van desde las condiciones metodológicas para el desarrollo de los ensayos como la evaluación en estática o dinámica, método de medición o categorización de formación de biofilm, el tipo de material utilizado como poliestireno o vidrio lo que influye en la fuerza de adhesión, tiempo de incubación, superficie de crecimiento, cantidad de nutrientes (Stepanović et al., 2001; Vanhommerig et al., 2014; Van Kerckhoven et al., 2016), hasta las características genotípicas y fenotípicas de los microorganismos en estudio (Mirani et al., 2013; Tiran et al., 2017).

La formación de biofilm no siempre puede ser considerado un factor de virulencia, dado que muchas bacterias no patógenas lo producen (Hall-Stoodley y Stoodley, 2005; Hancock et al., 2010). Sin embargo, la formación de biofilm por ciertos patógenos parece facilitar la supervivencia en el medio ambiente y en el huésped. La investigación en biofilm es por lo tanto un área de gran interés (Haussler y Parsek, 2010) la cual ha ganado reconocimiento en áreas como salud animal y pública.

Como se mencionó con anterioridad, en lo que respecta a la relación entre multirresistencia y formación de biofilm, existen varios escenarios que pueden explicar el contraste en resultados reportados a la fecha. Los resultados obtenidos en este trabajo mostraron una relación entre los aislados de mayor resistencia antibacteriana y una mayor formación de biofilm, esto evidencia que el biofilm es un factor indispensable para que la sensibilidad a antimicrobianos sea cada vez más baja; por lo que se puede inferir que la multirresistencia presentada por los aislados probados en este estudio, se debe a la formación de biofilm. Además de que existe la posibilidad de que se esté presentando un mecanismo combinado con la presencia de genes específicos que confieren resistencia a antibióticos. Sin embargo, se requiere de un estudio más detallado a nivel genético para comprobar esta hipótesis.

CONCLUSIÓN

En el presente trabajo se pudo demostrar que la capacidad de formación de biofilm de S. aureus aislados de mastitis bovina de los municipios del estado de Guanajuato, está relacionada directamente con el elevado grado de resistencia a los antimicrobianos, ya que los aislados del grupo de mayor resistencia presentan una mayor capacidad de formación de biofilm, en comparación al grupo de aislados sensibles.

La información obtenida es de gran ayuda en la descripción de los diferentes factores de virulencia que presentan los aislados de una región geográfica específica, ya que, con ello, eventualmente se podrán establecer mecanismos de control de la mastitis de manera más eficiente y personalizada en cada hato lechero.


LITERATURA CITADA

Chen, Y., Liu, T., Wang, K., Hou, C. Cai, S., Huang, Y., Du., Huang, H., Kong, J. and Chen, Y. 2016. Balcalein inhibit Staphylococcus aureus biofilm formation and the Quorum Sensing System In Vitro. Plos one, 11(4):1-18.

Coelho, S.M.O., Pereira, I.A., Soares, L.C., Pribul, B.R., Souza, M.M.S. 2011. Short comunication: Profile of virulence factors of Staphylococcus aureus isolated from subclinical bovine mastitis in the state of Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Dairy Science, 94(7):3305–3310.

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Haussler, S., Parsek, M.R. 2010. Biofilms 2009: New Perspectives at the Heart of Surface-Associated Microbial Communities. Journal of Bacteriology, 192(12):2941-2949.

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Melchior, A.B., Van Osch, M.H.J., Graat, R.M., van Duijkeren., Mevius, D.J., Nielen, M., Gaastra, W., Fink-Gremmels, J. 2009. Biofilms formation and genotyping of Staphylococcus aureus bovine mastitis isolates: Evidence for lack of penicillin-resistance in Agr-type II strains. Veterinary Microbiology, 137(1-2):83-89.

Mirani, Z.A., Aziz, M., Khan, M.N., Lal, I., Hassan, N.U., Khan, S.I. 2013. Biofilm formation and dispersal of Staphylococcus aureus under the influence of oxacillin. Microbial Pathogenesis, 61-62(2013):66-72.

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AGRADECIMIENTOS

La presente investigación fue financiada por la Universidad de Guanajuato a través de la Dirección de Apoyo a la Investigación y Posgrado en su Convocatoria 2018 (CIIC-077/2018), bajo la dirección de Dr. Abner J. Gutiérrez-Chávez y Dra. Julia Jaquelina Guzmán-Rodríguez.

COMENTARIOS

Gabriel Alvarez | Jalisco, México
12 de Feb, 2019 11:54:53 am
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Muy buen artículo, enhorabuena!

La resistencia de esta bacteria frente a las terapias antibióticas hace que sea muy difícil combatir, teniendo una importancia clave para luchar contra este tipo de mastitis el manejo y la prevención.

Es por eso que nuestra empresa, Hipra, sacó al mercado hace años STARTVAC®, la que hoy sigue siendo la única vacuna para prevención de S. aureus que actúa frente a la formación del biofilm.

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Saludos y, de nuevo, enhorabuena!

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