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Babesiosis bovina: Vacuna contra Babesia bovis y Babesia bigemina derivada del cultivo in vitro proliferadas en un medio libre de suero bovino

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  • Febrero 10, 2020
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Autor: Carmen Rojas Martínez¹
Colaboradores: J. Antonio Álvarez Martínez1, Julio V. Figueroa Millán1
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Laboratorio de babesiosis bovina, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud  e Inocuidad (CENID-SAI), Jiutepec, Mor., México.

Resumen


Se evaluó una vacuna viva atenuada con Babesia bovis y B. bigemina cultivadas in vitro con un medio libre de suero, y se determinó la protección clínica conferida en bovinos susceptibles confrontados en una explotación localizada en una zona de alta endemicidad a Babesia spp. Se conformaron tres grupos de seis animales cada uno. El grupo I (GI) recibió una vacuna derivada de parásitos cultivados con un medio libre de suero de bovino; grupo II (GII) se inmunizó con la vacuna estándar con parásitos cultivados en un medio suplementado con 40% (v/v) de suero bovino; y el testigo grupo III (GIII) inoculado con eritrocitos no infectados. Los inóculos se administraron por vía intramuscular (IM). Los animales experimentales después de la vacunación se mantuvieron durante 23 días en un rancho ubicado en una zona  libre de garrapatas y Babesia spp. Posteriormente, el ganado fue trasladado a un rancho ubicado en una zona de alta endemicidad con una seroprevalencia de 90%, en donde fueron expuestos naturalmente a garrapatas Rhipicephalus microplus infectadas con B. bovis y B. bigemina. Se realizó un monitoreo clínico diariamente, y se observó protección contra la babesiosis clínica. En el GI la protección fue del 100%, en el GII 80%. En contraste en el GIII la mortalidad fue del 100%, los bovinos mostraron simultáneamente  fiebre, disminución mayor al 25% del valor basal y la presencia de B. bovis y B. bigemina  en frotis sanguíneos al menos durante tres días consecutivos. Los títulos de anticuerpos contra B. bovis fueron más altos que los de B. bigemina en GI y GII, y los títulos más bajos se determinaron en GIII. Se demostró la capacidad protectora de la vacuna con B. bovis y B. bigemina derivada del cultivo in vitro en un medio sin suero.

Palabras clave: vacuna contra la babesiosis bovina, medio sin suero bovino, cultivo in vitro.


Introducción general


Babesia bovis
y B. bigemina son parásitos protozoarios intraeritrocíticos causantes de la babesiosis bovina. En México las garrapatas Rhipicephalus microplus y R. annulatus transmiten B. bovis y B. bigemina (Álvarez y Figueroa, 2005). Esta enfermedad se encuentra distribuida en las regiones tropicales y subtropicales y ocasiona grandes pérdidas económicas en la industria ganadera (Hunfeld et al., 2008). B. bovis es la especie más virulenta, los signos clínicos son muy severos, afecta el sistema nervioso central y causa un síndrome respiratorio que puede conducir a la muerte del animal afectado (Vial y Gorenflot,  2006). Se estiman pérdidas por 573.61 millones de dólares por año, asociadas al complejo garrapatas-Babesia (Rodriguez-Vivas et al., 2017). Es una enfermedad que obstaculiza la importación o movilización de ganado genéticamente superior para la producción de leche o carne, que se introduzca en regiones tropicales (Solorio-Rivera y Rodríguez, 1997). En nuestro país la magnitud de la enfermedad puede entenderse por las altas tasas de prevalencia, usualmente superiores al 50% en las áreas endémicas, lo que refleja el alto riesgo de la ocurrencia de brotes en animales susceptibles (Álvarez y Cantó, 1991).

Control de la babesiosis bovina


El control de la enfermedad puede ser por la aplicación de ixodicidas, movilización controlada de ganado, quimioterapia, quimioprofilaxis o con el uso de ganado resistente a las garrapatas. Estos métodos pueden ser efectivos en un programa integral, pero suelen ser costosos y poco prácticos (Rodríguez-Vivas et al., 2017). La inmunización es el procedimiento más apropiado para la prevención; lo cual, se ha demostrado con inmunógenos vivos (Dalgliesh et al., 1990; Shkap et al., 2007).

En México no existe una vacuna comercial; sin embargo, en el INIFAP se dispone de la metodología del cultivo in vitro de B. bovis y B. bigemina que se puede usar para la producción de una vacuna contra babesiosis. Estas cepas han sido evaluadas como vacuna y han protegido a bovinos susceptibles confrontados con cepas virulentas (Álvarez et al., 2004). Se ha demostrado protección del 80% en bovinos desafiados en condiciones de alta endemicidad. Inclusive, se ha usado en ganado nativo mantenido en condiciones inestabilidad enzoótica (Ojeda et al., 2010).


Naturaleza del problema

La metodología del cultivo in vitro aunque se mantiene de manera rutinaria, muestra como un serio inconveniente una baja eficiencia; que implica reducido nivel de eritrocitos parasitados y un limitado volumen de material en la cosecha. Además es forzoso suplementar el medio de cultivo con suero de bovino a una elevada proporción (30-50%) (Bautista-Garfias et al., 2015). Tradicionalmente el cultivo in vitro de Babesia spp. desde hace más de 35 años su usaba el medio M-199 con sales de Earle´s y RPMI-1640 son suplementados con suero de bovino. No obstante, el suero bovino en su composición regularmente muestra amplia variabilidad cualitativa y cuantitativa entre lotes. Asimismo, su inclusión favorece el crecimiento de agentes adventicios e incrementa el costo del mantenimiento del cultivo (Rojas et al., 2006).

Recientemente nuestro grupo de investigación modificó la metodología tradicional del cultivo in vitro de B. bovis y B. bigemina y logro eliminar el suero bovino sustituyéndolo por elementos vitales como insulina-transferrina selenito y putrescina a concentraciones definidas de 2000, 1100, 1.34, 0.1012 mg/L, respectivamente. También se logró incrementar la proliferación de ambas especies de Babesia utilizando un biorreactor de perfusión, con lo cual se elaboró un lote de vacuna con ambas especies. Por lo que el objetivo de este estudio fue evaluar condiciones de una confrontación natural, la protección que induce una vacuna derivada del cultivo in vitro (B. bovis y B. bigemina) proliferadas en un medio sin suero, suplementado con insulina-transferrina selenito y putrescina vs. la vacuna tradicional (Babesia bovis y B. bigemina) proliferadas en un medio de cultivo suplementado con 40% de suero de bovino. 

Materiales y métodos


Localización.
La investigación se realizó en dos fases; vacunación y confrontación. La vacunación se realizó en un rancho libre de garrapatas de R. microplus. Esto fue para permitir el establecimiento de los parásitos vacunales, durante 23 días. La confrontación fue natural, los animales fueron trasladados a un rancho ubicado en una zona tropical en el Golfo de México, donde la garrapata R. microplus es endémica. Los bovinos permanecieron fueron monitoreados durante 21 días, que fue tiempo suficiente para desarrollo de los signos característicos de la babesiosis clínica causada por las cepas de campo. Durante la confrontación no se aplicó ningún ixodicida en los animales experimentales.

Animales de estudio y vacunación. Se utilizó ganado de raza Holstein Friesian de un año de edad procedente de un área libre de garrapatas. Se probaron libres de Babesia spp, Anaplasma marginale, brucelosis, tuberculosis, leucosis, IBR y BDV. Los animales se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos de seis bovinos: Grupo I (GI) se inmunizaron con la vacuna derivada de parásitos de Babesia del cultivo in vitro sin suero bovino a dosis de 1x108 eritrocitos infectados de cada especie de Babesia (Bbig-SF y Bbov-SF). Grupo II (GII) fueron vacunados con la vacuna tradicional con 1x108 eritrocitos infectados de cada especie de Babesia (BOR y BIS) (Álvarez et al., 2004). El Grupo III (GIII) eran animales no vacunados, se usaron como grupo testigo y se inocularon con 2x108 eritrocitos de bovino no infectados (Fig. 1)

Los bovinos se manipularon de acuerdo con la NOM-062-ZOO-1999 “Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio. (http://www.senasica.gob.mx/?doc=743).



Recolección y procesamiento de muestras de plasma y paquete celular
. La sangre de los bovinos se obtuvo mediante venopunción yugular en tubos BD Vacutainer® K2 EDTA (Becton, Dickinson NJ, EE. UU.). La sangre se centrifugó a 1000 g durante 15 min. El plasma se separó y se transfirió a tubos Eppendorf de 2 ml (CORNING Inc., Kansas y EE. UU.) y se retiró la capa leucocitaria. El sedimento celular se lavó dos veces por centrifugación con solución salina equilibrada de Hank (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, EE. UU.). El plasma y los sedimentos celulares se mantuvieron en congelación a -20 ° C hasta su uso.

Antígeno para prueba de inmunofluorescencia indirecta. El antígeno utilizado fueron eritrocitos infectados con B. bovis y B. bigemina cultivados in vitro en medio sin suero bovino  (Bbig-SF y Bbov-SF). El material se cosechó cuando el porcentaje de eritrocitos parasitados (PEP) fue del 5% mediante transferencia a tubos de 50 ml y centrifugación a 450 g x 30 min a 4°C. El sobrenadante se desechó y los sedimentos se re-suspendieron en 45 ml de A-DMEM / F12 (Rojas-Martínez et al., 2017). A partir del paquete de eritrocitos se elaboraron frotis que fueron almacenados a -20 °C.

Determinación de la prevalencia de un rancho en una zona endémica. Este estudio se implementó en un rancho ubicado en un área tropical del Golfo de México, donde R. microplus es endémico, y se reporta una alta infestación de larvas en el  pasto y de larvas, ninfas y adultos en el ganado nativo. Se determino la seroprevalencia anti-Babesia muestreando al hato completo (N=187). Se detectaron anticuerpos específicos contra B. bovis y B. bigemina mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI). Para confirmar la presencia de Babesia spp. en los bovinos, las muestras de sangre se analizaron mediante PCR anidada (nPCR), según lo reportado por Figueroa et al. (1993).

Vigilancia clínica de los animales. Durante las fases de vacunación y desafío los animales se monitorearon individualmente. Se registró temperatura rectal (TR) (ºC) hematocrito (HT) (%). También se determinó la presencia y cuantificación de Babesia de cada animal mediante microscopía óptica en frotis teñidos con Giemsa. Se contaron al menos 1000 eritrocitos para determinar el PEP. Del plasma se determinaron los niveles de anticuerpos IgG contra B. bovis y B. bigemina (Bautista-Garfias et al. 2015).

Análisis estadístico. Se determinó la independencia entre la vacunación y la protección de la enfermedad clínica de los animales. Se utilizó la prueba exacta de Fisher (P <0.05) con respecto a variables de dos y tres categorías. Además, se generaron estadísticas descriptivas para variables tales como títulos de anticuerpos, período de incubación, temperatura rectal y hematocrito (McDonald, 2009).

Evaluación de protección. Cualquier animal se consideró clínicamente afectado con babesiosis aguda cuando los siguientes parámetros estaban presentes simultáneamente: 1) reducción del 25% HT; 2) TR superior a 40°C durante tres días consecutivos; y 3) detección de Babesia spp. en frotis. Cuando se cumplieron estos criterios, los animales fueron tratados con 3,5 mg / kg de diaceturato de 4, 4'-diazoaminodibenzamidina (babesicida) por vía intramuscular durante dos días consecutivos para evitar la muerte (Álvarez et al., 2004).

Resultados


Tasa de prevalencia de babesiosis bovina.
La seroprevalencia general observada en el hato del rancho donde se desafiaron los animales fue de 96% a Babesia spp. Específicamente 94% y 93% para B. bovis y B. bigemina por IFI. Por nPCR las tasas de prevalencia fueron 88% y 72% para B. bovis y B. bigemina, respectivamente. Estos resultados confirmaron que la explotación mantenía condición de endemicidad ideal para el desafío natural.

Vigilancia clínica de los animales.


Temperatura rectal (TR)
. Después de la vacunación, en el GI, hubo un aumento en la TR con un promedio de 39.4 °C. El cual, que fue más alto que los GII y GIII (<39 °C), particularmente en los días 9 -12. Los valores de TR en animales del  GI retornaron a los valores normales sin ningún tratamiento con babesicidas (datos no mostrados). Durante el desafío de campo, todos los animales en el GIII mostraron un aumento en TR mayor a 40ºC (promedio 41.4ºC), no así en los GI y GII, especialmente entre los días 13-16 después de la introducción a los potreros con pastos infestados de larvas.  Dos animales en el  GI mostraron temperaturas superiores a 40 ºC el día 16; mientras que en el GII tres bovinos mostraron temperaturas que oscilaban entre 40.2 y 40.5 °C en los días 13 y 16.

Hematocrito (Ht). Durante la vacunación, se mantuvieron en un rango normal (datos no mostrados). Sin embargo, durante el desafío, el Ht se redujo a un nivel ≥25% del valor basal, particularmente en el grupo control (GIII) en los días 17-19 después de la introducción a los potreros infestados de garrapatas. Desde el día 16, el hematocrito fue inferior al 20% en los tres grupos.

Porcentaje de eritrocitos parasitados (PEP). Durante la fase de vacunación, los parásitos no fueron detectados por microscopía óptica. Sin embargo, utilizando nPCR, se demostró la presencia de ambos parásitos (datos no mostrados). Durante todo el desafío, se detectaron parásitos en sangre en el GIII, y el PEP máximo fue de 0.285% en el día 16 después de la exposición a las garrapatas. En el GI y GII, los valores máximos de PEP se determinaron en 0.070% y 0.075%, respectivamente.

Niveles de anticuerpos IgG contra B. bovis y B. bigemina. La seroconversión de los animales vacunados (GI y GII) se determinó al día 14 después de la vacunación, para ambas especies B. bovis y B. bigemina (datos no mostrados). Durante el desafío, los niveles de IgG a B. bovis fueron mayores en los grupos de bovinos vacunados (GI y GII) en comparación con los animales del (GIII) determinado a los días 7 y 21. El día 21 después del desafío, los títulos para GI, GII y GIII fueron; 1: 5333, 1: 5226 y 1: 1696, respectivamente.


Los niveles más altos de anticuerpos IgG contra B. bigemina se observaron en el GII particularmente al día 21 después de la exposición. Los títulos promedio fueron 1: 693, 1: 2347 y 1: 400 en los grupos I, II y III, respectivamente (Fig. 2 A, B). La lectura de los portaobjetos preparados con parásitos cultivados in vitro en un medio sin suero mostró una reacción muy clara para ambas especies (Fig. 2 C, D).

Protección contra las infecciones por B. bovis y B. bigemina. El análisis general de los datos recopilados de los tres grupos indicó que el período de incubación en el grupo (GIII) fue de 10 días, en comparación con los bovinos vacunados que fue de 12 días (Tabla 1). De los tres grupos el GIII mostró la temperatura más alta (41.4ºC). Por el monitoreo clínico en el que se observaron signos severos de babeisosis, todos los GIII fueron tratados: Un animal en GII y ninguno fue tratado por GI. Las condiciones para administrar el tratamiento con babesicida a los bovinos ocurrieron entre 14 y 19 días después del desafío. La protección contra las infecciones por B. bovis y B. bigemina fue del 100%, 80% y 0% para GI, GII y GIII, respectivamente (Tabla 1). El análisis no paramétrico por la prueba exacta de Fisher mostró que la forma aguda de babesiosis o su ausencia no era independiente del tipo de vacuna utilizado (P <0.05).




Discusión


En este estudio, demostramos que las cepas de B. bovis y B. bigemina (Bbovis-SF, Bbig-SF) cultivadas en un medio libre de suero suplementado con insulina, transferrina, selenito y putrescina proliferadas en un biorreactor, son capaces de inducir una excelente respuesta inmune  contra babesiosis en el campo.

El aumento de la TR después de la vacunación en el GI y GII fue similar al observado en estudios previos sobre vacunas atenuadas contra la babesiosis bovina, que se ha documentado hasta ocho días después de la vacunación (Cantó et al., 2003). Además, se ha reportado un aumento breve de la temperatura corporal después de la vacunación para otras vacunas atenuadas exitosas contra diferentes patógenos (Kohl et al., 2004). La explicación más razonable para el aumento de la temperatura corporal es la estimulación adecuada de la respuesta inmune después de la exposición al antígeno, como se demostró previamente (Evans et al., 2015).En este estudio la TR observada en los grupos vacunados (GI y GII) es indicativa de la presencia Babesia, lo que se indicó mediante nPCR y está respaldado por observaciones previas (Bautista-Garfias et al., 2015)


Durante el desafío, la caída de HT observada en bovinos pertenecientes al grupo control en comparación con los grupos vacunados probablemente fue causada por una infección más grave con una especie nativa de Babesia. Esto también está respaldado por un PEP más bajo en los animales vacunados que en los no vacunados. Otros estudios han informado cambios similares en los valores de HT, con reducciones de más del 25% (Cantó et al., 2003b). En este estudio, es probable que el bajo HT observado en todos los bovinos experimentales se deba a una alta infestación de garrapatas durante el desafío, debido a que los animales no fueron tratados con ixodicidas. De modo que los diferentes estadios de garrapatas permanecieron siempre en el ganado (datos no mostrados). Otra investigación realizada en la mismo rancho confirma las continuas infestaciones de garrapatas en el pasto y el ganado (Bautista-Garfias et al., 2015).

La observación de que en la prueba de IFI se observaron claramente los parásitos fluorescentes puede estar relacionada con el hecho de que ambas especies de Babesia utilizadas como antígenos se derivaron del cultivo in vitro en un medio libre de suero, lo que facilita el reconocimiento de anticuerpos específicos. Los títulos de los niveles de anticuerpos anti-Babesia detectados por IFI encontrados en el presente estudio son similares a los reportados previamente en donde se utilizó una vacuna atenuada. Así mismo en este estudio se registraron títulos más altos para B. bovis que para B. bigemina, lo cual, previamente había sido reportado de mantera similar (Figueroa et al., 1998; Cantó 2003a).

En la presente investigación, no evaluamos la respuesta celular a Babesia spp., no obstante, los roles de las subpoblaciones de células T, los macrófagos y las moléculas involucradas en la respuesta inmune protectora a ambas especies de Babesia deben evaluarse. Aunque se sabe que la respuesta protectora de la infección por B. bovis requiere inmunidad innata y adaptativa que involucra a las células T CD4+ y anticuerpos neutralizantes. Asociados a la activación de macrófagos a través de IFN-g que mejora la producción de IgG2. Con lo que se pueden eliminar los parásitos por fagocitosis y la producción de metabolitos tóxicos como NO (Florin-Christensen et al., 2014). Es importante mencionar que de las vacunas disponibles contra la babesiosis bovina, faltan procedimientos estándar para obtener estos productos biológicos. En algunos casos las vacunas pueden causar la enfermedad clínica (Shkap et al., 2005; Rogers et al., 1998). Los resultados obtenidos en el presente estudio sugieren que los bovinos vacunados con B. bovis y B. bigemina derivados del cultivo in vitro en un medio sin suero (GI), estaban tan protegidos contra la infección natural como los inmunizados con la vacuna estándar (GII). Ambos inmunógenos mostraron un excelente nivel de protección frente a un desafío natural dentro. En este estudio, el porcentaje de protección fue mayor en animales GI que en animales GII (83.3% vs 100%). La comparación entre ambos grupos no fue adecuada para inferir ninguna diferencia estadística, debido al pequeño número de animales por grupo. En otros estudios, nuestro grupo de investigación, al utilizar la vacuna estándar, ha demostrado una protección de al menos el 80% en animales sin tratamiento previo en condiciones controladas y en el campo (Álvarez et al., 2004; Cantó et al., 1996; Figueroa et al., 1998). En futuros estudios, podríamos determinar si B. bovis y B. bigemina cultivadas en un medio sin suero confieren una mejor protección debido a la eliminación de proteínas en suero como lo sugieren otros investigadores (Grande et al., 1998; Brown et al., 1999).

Conclusión


Se concluye que una nueva vacuna contra la babesiosis bovina derivada del cultivo in vitro de B. bovis y B. bigemina en un medio sin suero, suplementado con insulina, transferrina, selenito y putrescina induce un excelente nivel de protección en bovinos susceptibles en una confrontación de campo. La eliminación del suero bovino del proceso para producción de vacuna y utilizando un biorreactor de perfusión nos permite disponer de mayor número de dosis vacunales, de mejor calidad a un menor costo y colateralmente se beneficia el bienestar animal. Estás innovaciones al cultivo in vitro de Babesia spp.  permitirán cubrir la demanda a nivel nacional de vacuna y diagnóstico de la Babesiosis bovina.

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COMENTARIOS

Francisco Garciafranciscogarcia | Jalisco, México
10 de Feb, 2020 10:37:12 am
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La noticia es excelente pero cuánto tiempo nos llevará tenerla disponible en el mercado. Por su respuesta gracias de antemano.

Carmen Rojas | Morelos, México
11 de Feb, 2020 10:12:08 am
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En nuestro CENID-SAI tenemos disponible la tecnología y el material biológico para la elaboración de vacuna; la transferencia de tecnología para la posterior producción a escala mayor y la comercialización corresponden a las autoridades directivas y a algún laboratorio de producción. Agradecemos las opiniones que han hecho sobre nuestro trabajo.

MARCO ANTONIO HIDALGO | CDMX, México
10 de Feb, 2020 12:30:32 pm
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Muy buen trabajo, ¡felicidades!

Eduardo Koppel | Tabasco, México
12 de Feb, 2020 02:14:57 am
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Con excelente trabajo se logró el exito. ¡Felicidades Carmen y Toño!. Esperamos la comercializacion, manténgannos informados. Saludos

Alfonso Verduzco | Zacatecas, México
19 de Feb, 2020 05:10:06 pm
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Médico Antonio, felicidades... espero me avise para la comercialización en Zacatecas, Jalisco y Colima con el Médico Pascual.

Gracias y saludos.

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