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Aumentan la posibilidad de reproducir al Venado Cola Blanca en laboratorio

  • Septiembre 07, 2020
  • 1,221

INTRODUCCIÓN

En ranchos ganaderos y profesionistas del área, un rancho cinegético o granja de venados representa un aspecto nuevo tanto en manejo como administración de la fauna, ganadería y agricultura. Con el uso de biotecnologías reproductivas en animales silvestres se usa como herramienta para mejorar (Clemente-Sánchez et al., 2017).

El uso de técnicas reproductivas en animales silvestres ha incrementado de manera significativa durante los últimos años, no solo con fines de conservación si no también se ha vuelto un enfoque de desarrollo de ranchos. Volviéndose así, un importante negocio en varios países. Algunas de dichas técnicas son: obtención de semen para ser congelado, sincronización de las hembras, inseminación artificial y transferencia de embriones ha sido investigada en varias especies de cérvidos. (Mart?nez et al., 2008).

Por otra parte, el procesamiento de semen, vitrificación de ovocitos y fertilización in vitro (FIV) en laboratorio, permiten la selección y uso de animales que sean genéticamente superiores para incrementar parámetros productivos. En cérvidos, la producción puede ser un incremento en la forma y tamaño de las astas, un mayor tamaño o peso corporal, cantidad y calidad de carne, producción de velvet y crías por año que son de importancia económica, así también disminuyendo el riesgo de patologías.(Clemente-Sánchez et al., 2017).

El objetivo del presente trabajo fue llevar a cabo la Maduración y Fertilización in vitro en ovocitos vitrificados con Trehalosa o Sacarosa de Venados Cola Blanca.


MATERIAL Y MÉTODOS

El siguiente estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Manejo de la Reproducción de la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco en la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Departamento de Ciencias de la Salud en la Ciudad de México. Bajo la asesoría de M.C. Javier Antillón de la Facultad de Zootecnia y Ecología de Universidad Autónoma de Chihuahua, Dr. Salvador Romo García de Facultad de Estudios superiores Cuautitlán de la Universidad Nacional Autónoma de México, Dr. Michael Kjelland de Conservation, Genetics & Biotech, LLC y Dr, Ernesto Hernández Pichardo y Dr. José Luis Rodríguez Suastegui de UAM- Xochimilco. Los ovocitos fueron vitrificados para su manejo posterior, dichos ovocitos se sometieron a diferentes pruebas de viabilidad y estado de la cromatina, MIV y FIV con semen congelado de venado cola blanca, ambos con previa preparación para ejecutar la técnica.
 

Se obtuvieron 2 ovarios por cada venada cola blanca, con un total de 9 venadas en un rancho cinegético en temporada reproductiva diciembre - enero durante la cacería. Los ovarios fueron colocados en medio Holding máximo 2 horas post-mortem. Una vez lavados los ovarios, se utilizó una hoja de bisturí con la que se realizan continuas incisiones para liberar los complejo-cumulo-ovocito (COCs) a una caja de Petri con medio Holding para la obtención de ovocitos, fueron evaluados en el microscopio estereoscópico para su procesamiento (Siriaroonrat et al., 2010).

Los ovocitos fueron crio-preservados como lo reporta (Yoshioka et al., 2014) con algunas modificaciones. La técnica utilizada fue vitrificación en superficie sólida, se utilizaron dos diferentes soluciones de vitrificación: Trehalosa (TH) o Sacarosa (SC). Los ovocitos se someten a el medio de equilibrio por 13-15 min, después se lavan 3 veces en gotas de 20 µl de solución de vitrificación y después se cargan los ovocitos en el capilar de la micropipeta en gotas de 2 a 3 µl de solución de vitrificación y se dejan caer sobre una balsa de aluminio flotando en nitrógeno líquido, en menos de 30 segundos en total se debe llevar a cabo el último paso. Las gotas vitrificadas se transfirieron a crio-tubos de 2 ml herméticamente cerrados, en un termo con nitrógeno líquido para su conservación (Yoshioka et al., 2014)

Para comenzar con la desvitrificación, mejor conocida como calentamiento, los medios fueron equilibrados por 20 minutos en la incubadora a 38º C y 5 % CO2 previo a iniciar el procedimiento.Se utilizó una balsa de aluminio con un filtro sobre el nitrógeno líquido, para vaciar el contenido con las gotas vitrificadas del crio tubo, posteriormente enjuagar con nitrógeno, para evitar pérdidas.

El medio de calentamiento fue el mismo para los dos medios utilizados para vitrificar. El medio w 1, se pone a calentar 500 ?m a baño María a 39 º C y posteriormente vaciarlo en el pozo 1. Los medios w- 2, 3,4 se colocarán 500 ?m en una caja de 4 pozos. Aparte, se preparó una caja Petri de 35 mm para el medio de lavado, previa a MIV (Yoshioka et al., 2014).  Después del calentamiento, se realizaron dos pruebas, una de viabilidad y otra para evaluar el estado de la cromatina por medio de las tinciones MTT y DAPI respectivamente.

Una vez recuperados los ovocitos previamente enjuagados con medio de maduración, se pondrán a madurar en grupos a 38.5 º C en incubadora por 24 a 36 horas en medio de maduración.
 

Para trabajar el semen congelado del venado, se preparó baño con nitrógeno en una hielera pequeña tener pinzas para pajillas de .25ml y tijeras. Una vez seleccionada la pajilla a fraccionar, y colocarla en el baño de nitrógeno para su manipulación. La fracción a utilizar fue seleccionada y el resto de la pajilla se coloca en el goblet. El resto de las fracciones no utilizadas, se colocan en un goblet en su bastón y se tapa con otro goblet.

Una vez realizado el corte, la fracción a utilizar se coloca en un tubo de plástico de 2 ml y se coloca a baño María por 2 minutos a 35 grados Celsius. Posteriormente, se procedió a la capacitación del semen para la FIV. En la campana de flujo, se quita el plástico de la pajilla y se enjuaga con medio de fertilización. 

Después, se evaluó al microscopio y se diluyó con el medio de capacitación para realizar la técnica de “Swim up”, la cual consiste en colocar el paquete celular al fondo con medio de capacitación centrifugarlo por 3 minutos. Los espermatozoides vivos, nadará hacia arriba y los espermatozoides muertos quedaran en la parte de abajo. Se evaluó la morfología y motilidad espermática.

Después de haber obtenido una respuesta positiva en MIV de los ovocitos se procedió a realizar la FIV. Para evaluar la fertilización se llevó a cabo la prueba de estado de cromatina del ovocito para determinar la presencia de pronúcleos, lo que indica que hubo fertilización.

RESULTADOS

Para determinar la asociación entre el uso de Trehalosa o Sacarosa de ovocitos vitrificados de venado cola blanca , su viabilidad y el estado de la cromatina después de la desvitrificación, así como su grado de MIV y éxito en la FIV, se corrió la prueba de Fisher . La asociación se consideró significativa cuando P<0.05.

La viabilidad de los ovocitos de VCB fue evaluada después de la etapa de desvitrificación.


El estado de la cromatina de los ovocitos se determinó al momento de la desvitrificación para identificar en qué etapa se encontraban, comparando los dos tratamientos: TH y SC. 


A las 36 h de MIV, se determinó el estado de la cromatina de los ovocitos en los grupos tratados con TH y con SC. Por lo tanto, bajo las condiciones de la presente investigación, no se observó una diferencia estadísticamente significativa (P>0.05) entre tratamientos. Por lo que no existió evidencia suficiente para afirmar que existe asociación entre el tipo de azúcar TH o SC, utilizado en la vitrificación de ovocitos en VCB al momento de someterlos a MIV.


Después de llevar a cabo la FIV, por medio de la evaluación del estado de la cromatina de los ovocitos, se determinó la etapa nuclear en la que se encontraba, haciendo una comparación entre los dos tratamientos TH y SC. Por lo tanto, bajo las condiciones de la presente investigación, no se observó ninguna diferencia entre los grupos evaluados (P>0.05), no existió evidencia suficiente para afirmar que existe asociación entre el tipo de azúcar (TH o SC) utilizado en la vitrificación de ovocitos de VCB y el estado de cromatina de los mismos al momento de la FIV.



DISCUSIÓN Y CONCUSIONES
 

Por medio de biotecnologías de la reproducción y el uso de la técnica de fertilización in vitro de los gametos de venado cola blanca se obtuvieron resultados preliminares, que sirven para iniciar una línea de investigación y se espera que constituya un modelo para futuras investigaciones. Se ha reportado maduración in vitro en venado cola blanca, sin embargo, la fertilización in vitro no ha sido reportada aún, por lo que este trabajo produjo información original para el mejoramiento genético y la conservación de esta especie.

ANEXOS

Ovocitos desvitrificados y después de la MIV (centro, izquierda y derecha)


Ovocitos teñidos con MTT (Izquierda) y DAPI (Derecha)


Ovocitos desvitrificados y semen descongelado, en la FIV de venado cola blanca.


LITERATURA CITADA
 

Clemente-Sánchez, F., J. Gallegos-Sánchez, and C. Cortéz-Romero. 2017. Manual de Reproducción Asistida para el Venado. Man. Reprod. Asistida para venado cola blanca.Colegio Postgraduados, Lab. Reprod. Anim. Campus San Luis Potosí, México. Verión 4:18–52.

Martínez, A. F., F. Martínez-Pastor, M. Álvarez, M. R. Fernández-Santos, M. C. Esteso, P. de Paz, J. J. Garde, and L. Anel. 2008. Sperm parameters on Iberian red deer: Electroejaculation and post-mortem collection. Theriogenology. 70:216–226. doi:10.1016/j.theriogenology.2008.04.001.

Siriaroonrat, B., P. Comizzoli, N. Songsasen, and S. L. Monfort. 2010. Oocyte quality and estradiol supplementation affect in vitro maturation success in the white-tailed deer ( Odocoileus virginianus ). 73:112–119. doi:10.1016/j.theriogenology.2009.08.007.

Yoshioka, K., F. Tanihara, H. Kaneko, and J. Noguchi. 2014. Generation of Live Piglets from Cryopreserved Oocytes for the First Time Using a Defined System for In Vitro Embryo Production. 9:1–9. doi:10.1371/journal.pone.0097731.

COMENTARIOS

Jose Avila | Veracruz, México
08 de Sep, 2020 07:00:15 am

RESPONDER

Gracias por la información, ¿dónde podría obtener asesoramiento para la cría y reproducción de venado cola blanca?

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